組織AMPK激酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到AMPK 磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生 ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應，即采用比色法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析組織裂解樣品中 AMPK活性的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中AMPK激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。

 

技術背景

 

5’AMP活化蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其為從酵母到人體高度進化保留的激酶復合物，由3個亞體，α、β、γ構成：其中γ亞體有4個胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）結構域，又稱為巴特曼（Bateman）結構域，以探測AMP和ATP的比例；α亞體含有催化結構域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 復合物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亞體都有不同異構體形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2 和γ3。其功能在于保持細胞能量內環境恒定：促進脂肪酸β氧化、抑制膽固醇合成、促進肌肉葡萄糖吸收和調節胰島素分泌等。AMPK在肝臟、腦和肌肉組織中高度表達。其磷酸化目標序列為 LKKLTRASFFGQ。基于底物LKKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反應方式為：

 

產品內容

 清理液（Reagent A）毫升

 裂解液（Reagent B）毫升

 緩沖液（Reagent C）毫升

 酶促液（Reagent D）微升

 反應液（Reagent E）微升

 底物液（Reagent F）微升

 陰性液（Reagent G）微升

產品說明書1 份

保存方式

 

保存 清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證 6 月

 

用戶自備

 

AMPK激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

比色皿或酶標板：用于比色分析操作的容器分光光度儀或酶標儀：用于樣品比色分析

 

 組織AMPK 激酶活性比色法定量檢測試劑盒實驗步驟

 

一、 待測樣品準備

 

1.手術取出動物組織，并秤重 500 毫克組織重量

2.（選擇步驟）放進預冷的 15 毫升錐形離心管

3.（選擇步驟）加入毫升  清理液（Reagent A）清洗

4.（選擇步驟）抽去清理液

5.移入到一個液氮凍存管

6.即刻放進液氮罐過夜

7.次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8.放進一個 15 毫升錐形離心管

9.加入置于冰槽里的微升  裂解液（Reagent B） 10．強力渦旋震蕩 30 秒，充分混勻

11.放進冰槽里孵育 30 分鐘，期間每 10 分鐘強力渦旋震蕩 30 秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）

12.即刻放進 4℃臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 10000g

13.小心移取上清液到新的無菌的 1.5 毫升離心管

14.移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－（GMS30030.1）

15.放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、測定準備

1.準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里

2.設定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數 6次（共5分鐘），并置零

三、 背景對照測定

 

1.移取微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2.加入微升  酶促液（Reagent D）

3.加入微升  陰性液（Reagent G）

4.放進 30℃培養箱里靜置 2 分鐘

5.（選擇步驟）放進分光光度儀，置零

6.（選擇步驟）取出比色皿

 

7.加入微升  反應液（Reagent E）

8.加入微升  底物液（Reagent F）

9.上下傾倒數次，混勻（限定在3 秒之內）
10．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 5 分鐘

 

四、 樣品測定

 

 

1.移取微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2.加入微升  酶促液（Reagent D）

3.加入 5 微升待測樣品（注意：50 微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）

4.放進 30℃培養箱里靜置 2 分鐘

5.（選擇步驟）放進分光光度儀，置零

6.（選擇步驟）取出比色皿

7.加入微升  反應液（Reagent E）

8.加入升  底物液（Reagent F）

9.上下傾倒數次，混勻（限定在 3秒之內）
10．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 5 分鐘

 

五、 計算樣品活性

 

單位＝微摩爾 NADH/分鐘六、酶標板測定

1.在 96 孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品

2.分別移取微升  緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中

3.分別加入微升  酶促液（Reagent D）

4.分別加入 5 微升  陰性液（Reagent G）或待測樣品（50 微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）

5.輕輕搖動 96 孔酶標板

6.在 30℃溫度下孵育 2 分鐘

7.分別加入微升  反應液（Reagent E）

8.分別加入微升  底物液（Reagent F）

9.輕輕搖動酶標板

10.即刻放進酶標儀檢測：0 分鐘讀數和 5 分鐘讀數

11.活性計算：

 

單位＝微摩爾 NADH/分鐘七、抑制劑篩選

 

1.在 96 孔酶標板上做好相應標記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品

2.按下表加入試劑

 

內容物樣本背景完全酶活性待測抑制劑酶活性

 緩沖液

（Reagent C）微升微升微升

 陰性液

（Reagent G）微升————

待測抑制劑微升――微升

用戶自備的純化酶——微升（1 毫單位）微升（1 毫單位）

96 孔板每孔總量樣本背景孔

（  微升）完全活性孔

（  微升）待測抑制劑樣品孔

（ 微升）

 

3.輕輕搖動酶標板，混勻

4.放進 30℃培養箱里靜置 30 分鐘

5.分別加入微升  酶促液（Reagent D）

6.分別加入微升  反應液（Reagent E）

7.分別加入微升  底物液（Reagent F）

8.輕輕搖動酶標板

9.即刻放進酶標儀檢測：獲得初始吸光讀數（OD） 10．放進    30℃培養箱里孵育    30        分鐘11．即刻放進酶標儀檢測：獲得終點吸光讀數（OD）

12．實際吸光讀數：初始吸光讀數（OD）—終點吸光讀數（OD）

13．抑制活性計算：

1)

2)IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度

 

3） 直接構建抑制曲線：縱座標（Y 軸）為吸光讀數 OD；橫座標（X 軸）為已知抑制劑濃度

 

注意事項

 

1.本產品為 25 次操作，包括背景操作

2.操作時，須戴手套

3.系統操作過程中，背景測定只需 1 次

4.樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5.樣品須澄清，至關重要

6.加入  底物液（Reagent F）后 3 秒內即刻比色測定

7.測定值由高到低變化；測定可持續 30 分鐘

8.比色測定后，比色皿須清洗徹底

9.樣本測定 0 分鐘讀數高于 5 分鐘讀數表明具有酶活性

10.建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供  Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－

GMS30030.1）

11.如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

12.可以使用 AMPK 抑制劑（DORSOMORPHIN）作為抑制劑對照或陰性對照

13．5’AMP 活化蛋白激酶活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 7.5 條件下，每分鐘內能夠氧化 1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

14．本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

1.本產品經鑒定性能穩定

2.本產品經鑒定檢測敏感

 

 組織AMPK 激酶活性比色法定量檢測試劑盒使用承諾

 

秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后， 應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后 10 天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告） 與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。