高效液相色譜法（HPLC)色譜峰展寬的原因

    高效液相色譜法的分離原理與經(jīng)典液相色譜法一致，流程、柱效又與氣相色譜法類似，他們主要是流動(dòng)相的不同。GC的流動(dòng)相是氣體、HPLC的流動(dòng)相是液體、氣體和液體在粘度、擴(kuò)散系數(shù)、密度等方面存在明顯差別。因此。高效液相色譜法與期限色譜法在某些公式和參數(shù)上有一定的差別。下面根據(jù)高效液相色譜法的特點(diǎn)進(jìn)行色譜理論討論。

色譜峰展寬是指由于柱內(nèi)外各種因素引起的色譜峰變寬或變形。從而造成柱效降低。由于液相色譜流動(dòng)相是液體。擴(kuò)散系數(shù)小，粘度大，傳質(zhì)速度慢。同時(shí)高效液相色譜柱尺寸比起氣相色譜柱尺寸要小很多。柱外死體積影響變得特別重要。因此在高校液相色譜法中要特別重視普峰展寬問(wèn)題。

影響色譜峰展寬的一些獨(dú)立因素可用方差α按下列關(guān)系式相加：

α=α柱+α檢+α普+α選+α其他

式中α總是所觀察到的方差、α柱是柱方差，而α檢、α普、α進(jìn)和α其他則分別是在檢測(cè)器、連接管道和進(jìn)樣等產(chǎn)生的方差。當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)的柱外效應(yīng)不大時(shí)，則：

               α總=α柱

柱外效應(yīng)使α總大于α柱，它使色譜分離度不能達(dá)到柱子固有的能力，所以應(yīng)當(dāng)盡量減少柱外效應(yīng)。由于α的大小是柱效高低的反應(yīng)，因此理論塔高度可定義為每單位柱長(zhǎng)（L）的方差

             H=α/L

  Α=              

峰寬為4α，所以峰寬為4因而短柱和高柱效的柱子使色譜峰展寬變小。

譜帶公國(guó)色譜柱時(shí)，由于擴(kuò)散作用，會(huì)展寬或擴(kuò)展。由于液相色譜和氣象色譜所用的流動(dòng)相在性質(zhì)上有很大的差別。加入，在液體里的擴(kuò)散系數(shù)比在其體力的約小倍。液體流動(dòng)相的粘度要比氣體的粘度大100倍左右。另外，在氣象色譜法里流動(dòng)相和樣品分子之間的相互作用可以忽略不計(jì)，而液相色譜法里他們起著重要作用。液相色譜法在理論上的分析要比期限色譜法簡(jiǎn)單，這是液體流動(dòng)相在使用的壓力范圍內(nèi)不可壓縮的。柱內(nèi)譜帶展寬可通過(guò)Van Deemter方程式來(lái)討論。

（1）渦流擴(kuò)散相

           =

式中，為渦流擴(kuò)散引起的板高，為填充不規(guī)則銀子，其值在1-2之間，是常數(shù)

（2）縱向擴(kuò)散相

         =

是由在流動(dòng)相中分子擴(kuò)散而引起的板高，其值與擴(kuò)散系數(shù)與樣品在柱內(nèi)消耗的時(shí)間成正比。彎曲因子γ是一無(wú)量綱的常數(shù)，它并非完全與流動(dòng)相線速度無(wú)關(guān)，在低線速度時(shí)，彎曲因子是由柱中填充緊的部分和松的部分平均作用所決定的。而在高線速時(shí)，它主要是由填充松的部分所決定的。在填充柱中。彎曲因子的典型值在0.6-0.8之間，在開管柱中，為1.0

在液體里的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體里的擴(kuò)散系數(shù)要小，因此在液相色譜里流速大于0.5cm./s時(shí)，他對(duì)譜帶展寬的影響常可以忽略不計(jì)。

（3）傳質(zhì)阻力項(xiàng) 在流動(dòng)相和固定相中質(zhì)量轉(zhuǎn)移不是瞬間能達(dá)到的，其傳質(zhì)阻力包括固定相傳質(zhì)阻力（）流動(dòng)相傳質(zhì)阻力Hm和滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力Hnm

                              =H2+Hm+Hnm

1固定相傳質(zhì)阻力Hm：主要發(fā)生在分配色譜中，與氣液色譜法中液相傳質(zhì)相類同

2流動(dòng)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力Hm:它是由同一流路中靠近固定相表面處流速較慢而流路中心流速較快而造成，如圖

式中，為填料顆粒平均直徑；Dm為組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)；Cm為與容量銀子有關(guān)的常數(shù)，顯然，填料顆粒越小，即流路越窄，Hm就越小。

3滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力Hm;當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)填充柱中，在空襲中的液體相對(duì)于顆粒間通道的中心區(qū)域的液體是停滯的。停滯區(qū)有兩種情況；一是停滯在空襲中的液體占有的空間，二是液體停留在顆粒內(nèi)部的空間。停滯的流動(dòng)相的擴(kuò)散相對(duì)是低的，必然降低傳質(zhì)速率，固定相的微孔越深，傳質(zhì)速率就越慢，峰展寬越大。

式中，Cnm是與顆粒微孔和容量銀子有關(guān)的常數(shù)。

期限色譜法主要考慮固定相的傳質(zhì)阻力；液相色譜則主要考慮流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力，特別是滯留流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力在整個(gè)傳質(zhì)過(guò)程中起主要作用。因此，改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。

綜上所訴，由柱內(nèi)展寬所引起的板高變化可歸納為

若將上式簡(jiǎn)化，可寫作

H=A+Cu

從上式可看出，塔板高度與固定相直徑關(guān)系最密切，下圖能說(shuō)明此問(wèn)題關(guān)系

固定相顆粒直徑越小，板高越小，理論塔板數(shù)越大，茨曲線的斜率大大降低，這樣可在較高的流動(dòng)相線速度下，保持較高的柱效，達(dá)高效高速。

降低流動(dòng)相粘度，可提高樣品分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)而降低板高。另外，提高裝柱技術(shù)而降低填充不不規(guī)則銀子，降低流速等也可降低板高，提高柱效。

柱外展寬在液相色譜中需比在期限色譜中更為引起中藥，由于樣品分子在液體流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)低，致使進(jìn)樣器的死體積、色譜柱和檢測(cè)器之間連接管道的死體積以及檢測(cè)器本身的體積，對(duì)譜帶展寬有相當(dāng)大的影響。連接管道和檢測(cè)器的體積相對(duì)樣品的保留體積較大。譜帶展寬越嚴(yán)重，會(huì)使柱效明顯下降。