酶聯免疫吸附檢測法（elisa）測定植物激素含量

    在研究植物生命過程中，常常需要準確了解某一些激素的含量，以及個激素間的比例，因此，植物內源激素的提取、分離、測定是植物生理學實驗技術中機器重要的內容。

植物激素（Planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析（RIA)和沒聯系福面議分析（elisa），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一種類型。在ELISA中，抗原抗體反應的檢測依靠酶標記物來實現，常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標記激素分子，成為酶標植物激素，稱為酶標植物激素，也可標記于第二抗體（識別抗激素抗體Fc片段的抗體獲金黃色葡萄球菌A蛋白），稱為酶標二抗。這兩類標記物分別用于固相抗體型和固相抗原性ELISA。

A .固相抗原型ELISA；將抗激素的但可控抗體(MAb）與一吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體（RAMIG)結合，然后加入激素標準品或待測樣品，時期與固相化的MAb結合，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記激素（酶標激素）。通過測定酶標激素的被結合量，可換算除未知樣品中激素的數量。

B.固相抗原性ELISA；將“激素-蛋白”復合物（該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白）包被于固相載體，加入待測激素（樣品或標準品）和抗IAA多克隆抗體（PAb)反應，進行競爭反應。然后讓HRP標記羊抗兔Ig抗體（HRP-GARIG)與結合的固相上的PAb反應，通過測定與固相結合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量。

實例：

材料：高等植物、真菌、藻類等組織或器官。

儀器：酶聯免疫檢測儀、高速冷凍離心機、恒溫箱、連續進樣器、渦旋儀。96孔微孔板、離心管、研缽、或勻漿器、試管、剪刀、天平（0.0001g）、液氮罐、水浴鍋、氮氣裝置、試管架、橡膠管、注射針頭、C18柱。

試劑：洗滌緩沖液：0.01mol/L PH7.4磷酸緩沖液（PBS),含0.05%Tween-20 、PBS:8.0gNaCl、0.2gNaCl、0.2gKH2PO4、2.96gNa2HPO4·12H2O榮譽100ml蒸餾水中；

RAMIG溶液或“激素-蛋白”復合物;

0.1%封閉蛋白（該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白）

抗激素MAb或PAb:

激素標準品木業及殘幣系類溶液（按雙倍或四倍系列稀釋）；

HRP標記激素或HRP-GARIG;

鄰苯二胺（OPD）基質液：5mgOPD榮譽12.5ml 0.01mol/L PH5.0PBS，用前加入30%H2O212.5ul；

3 mol/L H2SO4;

80%甲醇；

樣品稀釋液：100mlPBS溶解0.1g白明膠；

1mmol/L二叔丁基對苯酚。

過程

（一）激素的提取

快讀稱取新鮮的植物材料0.5000g(若取樣后不能馬上測定，要用液氮速凍0.5-1h后保存于-40℃冰箱中），將樣品提取液，冰浴下研磨成勻漿，轉入試管，4℃下提取4小時，4000rpm離心15min，取上清液，提取兩次那個合并上清液。上清液C18柱，去除干擾物，在40-45℃水浴下用氮氣吹干或冷凍干燥。用樣品稀釋液定容。渦旋器混勻后用于測定。

（二）激素的測定

1、固相抗體型ELISA

 （1）、用方陣法滴定選擇個反應物最適工作濃度；

（2）、將100ul RAMIG溶液包被聚苯乙烯反應板微孔，4℃濕盒內放置12H

（3）、棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；

（4）、加入100ul抗激素MAb溶液，37℃下放置70min；

（5）棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干

（6）各孔內一次計入50ul待測樣液，每個樣品3次重復，15-20℃下放置20min

（7）計入5ulHRP標記激素，37℃下放置60min；

（8）棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

（9）加入100ulOPD基質液，37℃顯色15-20min，加入50ul 3mol/l H2SO4中止反應。用酶聯免疫檢測儀測定490nm下各孔的A值，求出每份樣品重復孔的平局值。

（10）用激素標準母液和參比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。

2、固相抗原ELISA

(1)、用主陣法滴定選擇各反應物最適工作濃度；

(2)將100ul激素-蛋白復合物溶液包被于微孔板，37℃下放置12h

(3)、棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；

(4)、加入100ul0.1%封閉蛋白溶液封閉，37℃放置30min。

(5)、棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；

(6)、隔空同時加入50ul樣液和50ul抗激素PAb溶液，液加入正常兔血清溶液的孔（非特異吸附孔）為空白凋零，37℃下放置60min。

(7)、棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

(8)、加入100ul HRP-GARIG溶液，37℃下放置60min。

(9)、棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；

(10)、隨后的顯色、終止與比色程序同上。

(11)、用激素標準參比溶液，在同一微孔板上同上法操作。、

固相抗體型ELISA結果計算：

以加入激素母液的孔（非特異吸附孔）為空白凋零，已加入不含激素的PBS的空為B0孔，以加入激素標準參考系列溶液的隔空為Bi孔。以標準激素摩爾數的常用對數log[激素]為橫坐標，對應的IN[B1/(Bo-Bi)]為縱坐標 ，可得一條Y=a+bX直線。

將樣品孔的A490值帶入上式，換算出待測樣品中激素摩爾數量，誠意稀釋倍數，除以樣品重量，即為每克樣品的激素含量。

固相抗原型elisa結果計算

以加入不含激素的磷酸緩沖液的孔為Bo孔，以加入激素標準參考系列溶液的各孔為Bi孔。標準曲線計算與結果分析同上。