注意：正式測定之前選擇2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 0.33mL×2 瓶，4℃保存；用時每瓶加入5mL 試劑一；用不完的試劑4℃保存一周； 

試劑三：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說明：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD 催化 H2O2 氧化特定底物， 在470nm有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、 細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入

1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、 血清（漿）樣品：直接檢測。二、測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至470nm，蒸餾水調(diào)零。

2、測定前將試劑一、二和三 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置10min。

3、樣本測定表

試劑名稱（µL）測定管

樣本15

蒸餾水270

試劑一520

試劑二130

試劑三135

在1mL玻璃比色皿中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時，記錄470nm下30s 時的吸光值

A1和1min30s后的吸光值A(chǔ)2。計算ΔA＝A2-A1。

注意：

a.若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液，在 37℃（哺乳動物） 或 25℃（其它物種）放置10min 以上，測定時加入15µL 樣本和1055µL 混合液測定。

b.如果ΔA 小于0.005，可將反應(yīng)時間延長到5min。如果ΔA 大于0.5，可將樣本用提取液稀釋后測定，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

三、POD 活性計算：

1、 血清（漿）POD 活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化0.01 為一個酶活力單位。計算公式：POD（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =7133×ΔA

2、 組織、細菌或細胞 POD 活性

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/g鮮重）＝ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞數(shù)量計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/104 cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V 樣總)÷0.01÷T=14.27×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.07mL；V樣：加入樣本體積，0.015mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。