動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在單克隆抗體制備中的應(yīng)用
抗體作為疾病預(yù)防、診斷和治療的制劑已有上百年的發(fā)展歷史。早期制備抗體的方法是將某些天然抗原經(jīng)各種途徑面議動(dòng)物，成熟的B細(xì)胞可控受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。實(shí)際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。多可控抗體 是人類(lèi)有目的利用抗體的第一步。多克隆抗體的不均一性，限制了對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的單克隆抗體獲1984年諾貝爾獎(jiǎng)。雜交瘤技術(shù)的誕生被認(rèn)為是抗體工程發(fā)展的第一次質(zhì)的飛躍，也是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑。利用這種技術(shù)這杯的單克隆抗體的疾病診斷、治療和科學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。抗體所針對(duì)的抗原包括半抗原、具有生物活性的天然產(chǎn)物、神經(jīng)肽、激素、酶和其他蛋白、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、核酸、組織相容性抗原、分化抗原、自身抗原、細(xì)胞表面粘附分子等。這些抗原可以來(lái)自病毒、支原體、細(xì)菌、原蟲(chóng)、寄生蟲(chóng)、正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞。 雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過(guò)融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是B淋巴細(xì)胞和經(jīng)抗原免疫的小鼠細(xì)胞做小鼠骨髓瘤細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)（選擇遠(yuǎn)離見(jiàn)后），小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無(wú)線分裂、增殖、即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有B瞎報(bào)與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆。
細(xì)胞的選擇與融合
建立在雜交瘤技術(shù)的制備針對(duì)抗原特異的單克隆抗體所以融合細(xì)胞一方必須選擇經(jīng)過(guò)抗原免疫的B細(xì)胞，通常來(lái)源于免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞。脾是B細(xì)胞聚集的中藥場(chǎng)所，無(wú)論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會(huì)出現(xiàn)銘心啊的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細(xì)胞的另一方則是為了保持細(xì)胞融合后細(xì)胞的不斷增值，只有腫瘤細(xì)胞才具備這種特性。選擇同一體系的細(xì)胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是B 細(xì)胞系惡性腫瘤。所以是理性的脾細(xì)胞融合伴侶。目前常用的B細(xì)胞瘤株有：P3-X63-Ag8，P3-NSI/1-Ag4-1,X63-Ag8. 563 Sp2/0-Ag14等，這些細(xì)胞株皆為HAT敏感細(xì)胞株。
使用細(xì)胞融合劑造成細(xì)胞膜一定程度的損傷，使細(xì)胞抑郁相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細(xì)胞損傷而又產(chǎn)生坐高頻率的融合。聚乙二醇是目前最常用的細(xì)胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40%。
細(xì)胞融合是一個(gè)瑞吉的物理過(guò)程。在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞呵呵細(xì)胞懸中，經(jīng)融合細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)。如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未熔合的脾細(xì)胞、未熔合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅5-7d，無(wú)需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。而為融合的瘤細(xì)胞則需要驚醒特別的篩選去除
細(xì)胞DNA合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，也算作為重要的輔酶參與這一合成過(guò)程。意義輔助途徑是次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶核苷，所以取三者的字頭成為HAT培養(yǎng)基、其中氨甲喋呤是也算的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑和成DNA，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT細(xì)胞株，所以不能再該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因此只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活于繁殖。 在動(dòng)物勉一中，應(yīng)選用高純度抗原。一種抗原往往有多個(gè)決定簇，一個(gè)動(dòng)物在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，實(shí)質(zhì)是眾多B細(xì)胞群的抗體分泌。而針對(duì)目標(biāo)抗原表位的B細(xì)胞只占極少部分。而且由于細(xì)胞融合是隨機(jī)的過(guò)程，在已經(jīng)融合的細(xì)胞中，有相當(dāng)比例的無(wú)關(guān)細(xì)胞的融合體，因此需要篩選去除。篩選過(guò)程一般分為兩步進(jìn)行：意識(shí)融合稀薄啊的抗體篩選，而是再次基礎(chǔ)上進(jìn)行的特異性抗體篩選。將融合的細(xì)胞驚醒充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間（30%的孔為0才能保證每個(gè)孔中是單個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞；這一過(guò)程常被習(xí)慣地稱作單克隆。將這些陽(yáng)性細(xì)胞在進(jìn)行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽(yáng)性細(xì)胞株，增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)。 單克隆抗體的制備是一個(gè)復(fù)雜、精細(xì)的工藝。為對(duì)全過(guò)程有一個(gè)概括的了解，一般講全過(guò)程分為三個(gè)階段；免疫小鼠；建立篩選方法和程序；雜交瘤生成。
上圖每一階段都有可能迅速順利完成，單個(gè)階段也都有其本身的問(wèn)題，需要在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前予以充分考慮，以免影響全局。動(dòng)物再注入抗原后，一旦出現(xiàn)良好的液體免疫應(yīng)答，同時(shí)又已建立合用的篩選方法，病通過(guò)血清對(duì)所建立篩選方法進(jìn)行評(píng)價(jià)、確定方法后，才可開(kāi)始雜交瘤細(xì)胞的制備。其過(guò)程大致為；在細(xì)胞融合前數(shù)日，用抗原免疫動(dòng)物；將從免疫動(dòng)物得到的分泌抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞想混，經(jīng)行細(xì)胞融合（有效地細(xì)胞融合約可得1/10
存活的雜交細(xì)胞）；其后，將融合細(xì)胞用所選擇的培養(yǎng)基限定稀釋，置多空培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞融合后1周，即可對(duì)雜交瘤進(jìn)行測(cè)試，從陽(yáng)性培養(yǎng)孔所取的細(xì)胞先增殖，然后，進(jìn)行單克隆（即但可控生長(zhǎng)），雜交瘤的生成與克隆需要時(shí)間，很少的實(shí)力只需要2個(gè)月，有的甚至要1年時(shí)間。因制備但可控抗體過(guò)程中每一步都對(duì)其后各步影響很大，因此均需zhuy8i選擇最適宜的條件，如：要注意抗原的選擇及其性質(zhì)，如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、半抗原等；根據(jù)抗原得性質(zhì)和得量和對(duì)抗體得要求等，計(jì)劃及建立免疫的途徑和方式；選定抗體篩選的測(cè)定方法必須簡(jiǎn)單、可重復(fù)、特異、并可適用于單克隆抗體的最終適用(即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗(yàn)等中的應(yīng)用）要確定細(xì)胞培養(yǎng)的條件；細(xì)胞融合的方式應(yīng)考慮雜交方法，細(xì)胞的選擇和可控的方式等。
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