脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）試劑盒說明書
點擊次數：1062 日期：2017/8/16 16:24:13
脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48 樣
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
DHAR 存在于細胞質、線粒體和葉綠體中。DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA 和 GSSG，調控細胞 AsA/DHA 比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環的關鍵酶。提高植物體內的 DHAR 活性，可提高植物食品中 AsA 含量，進而提高植物食品的營養品質。
測定原理：
DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA，通過測定 DHA 減少速率，計算 DHAR 活性。
實驗中所需儀器及設備：
研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調式移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 35 mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。
試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。
粗酶液提取：
按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。
細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議
500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；8000g 4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測。
血清等液體：直接測定。
DHAR 測定操作：
分光光度計預熱 30 min，調節波長到 265nm，蒸餾水調零。
試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min。
在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 上清液、100μL 試劑三、100μL 試劑四和 700μL 試劑二，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A2-A1。
DHAR 活性計算公式：
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。 DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷(Cpr×V 樣)÷T
= 92×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。
DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
92×△A ÷W
(3). 按細胞數量計算
活性單位定義：25℃中每 104 個細胞每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。
DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷(細胞數量×V 樣÷V 樣總)÷T
92×△A ÷細胞數量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。
DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V 反總×109÷V 樣÷T92×△A ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數為 5.42×104 L/mol /cm；109：摩爾分子換算成納摩爾分子；d：比色杯光徑，1 cm；V 反總：反應體系總體積，1mL=0.001 L；V 樣：反應體系中加入上清液體積，100μL =0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，2 min。
注意事項：
臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內使用完。
技術支持:阿儀網
