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多步核分離和染色程序

點擊次數:1402 日期:2016/7/27 9:05:47

多步核分離和染色程序
 
     Vindelv等人1983年報道了對實體組織(包括腫瘤組織)長期貯存、脫核制備和染色的多步綜合處理,這種方法采用胰酶消化和PI染色,廣泛地用于人和屬各種實體組織的脫核染色制備。制備的流程如圖所示。
        
      多步分散程序流程圖
 
     多步分散程序的方法為:首先制備幾種工作溶液。
     檸檬酸緩沖液:將85.50g蔗糖(250mM)、檸檬酸三鈉。2H2O,11.76g(40mM)溶于約800ml蒸餾水,再加入50ml二甲基亞砜(DMSO),加入蒸餾水至總體1000ml,pH7.6。
     貯液:貯液用于制備A液、B液、C液和流式細胞計的鞘液中。將2000mg(3.4mM)檸檬酸三鈉·2H2O,2000ul(0.1%V/V)NonidetP40(NP40),1044mg(1.5mM)四氯酸精胺,121mg(0.5mM)羥甲基甲胺(Tris)加入蒸餾水中,使總體積為2000ml,pH7.6.
   A液:將15mg胰酸溶于500ml貯液中,pH7.6.
   B液:將250mg胰酶仰制劑和50mg RNA酶A溶于500ml  貯液中,pH7.6.
   C液:將208mg PI和580mg四氯酸精胺加至500ml貯液中,pH7.6,注意C液在制備、貯存和染色過程中都應避光。
染色溶液的長期貯存方法:分裝成5ml的染液在塑料管中存貯于—80℃中。使用前,將貯存的染液立即入37℃的水浴中。然后將A液和B液在室溫下保存,直到使用,C液保持在水浴中。
 細胞的長期貯存方法:不立即進行染色和分析的樣品,可以長期冰凍保存。具體方法是:將檸檬酸緩沖液每400ul分裝在聚丙烯管中,每管可懸浮大約106細胞,將管立即浸入干冰和99%乙醇(—80℃)的混合液中,然后存貯于—80℃冰箱中。分析前,將樣品迅速地置于37℃水浴中,準備染色。
染色方法:將1800ulA液加到200ul檸檬酸緩沖液的細胞懸液中,將管慢慢倒置,混勻。在室溫下,10分鐘內,將管輕輕上下倒置5一6次,然后加入1500uIB液,在室溫下,10分鐘內輕輕上下倒置幾次。再加入1500uIC液(原在水浴中),輕輕將管倒置。避光條件下,通過一個30um的尼龍網過濾樣品,然后將樣品置入冰浴中,加入C液染色后,在15分鐘到3小時之間,可進行流式光度分析。
這種方法很適用于沒有固定的針吸樣品。非離子去污劑用于溶解細胞,精胺用于穩定未固定的核。精胺的適用濃度是很嚴格的,濃度如偏低對穩定核膜無效,濃度偏高將導致胞核、胞質和未溶解細胞的污染。胰酶能消化細胞質碎片,胰酶仰制劑使胰酶失活,RNA酶可除去RNA的非特異熒光。PI用于DNA熒光染色(參見熒光探針PI染色)。
這種方法的實驗結果表明:樣品在—80℃存貯并經去污劑處理和胰酶消化,細胞丟失很少,所獲得細胞核的DNA分布與用同種樣品獲得單個細胞DNA分布是類似的,細胞周期各時相百分數也是類似的。DNA分布顯示出很小的細胞從結,可獲得很低的CV值。DNA染色是高度定量的,能夠區分DNA的微小差別(例如人類性染色體)。應指出的是:如果原樣品中組織高度壞死或化療引起大量細胞死亡,核分散處理后將會產生一些自溶的核和很多碎片,來自壞死組織的核比來自活細胞的核光散射值和熒光強度都高。另外,來自鼠精子的熒光強度比預料的要低。
總之,使用核懸液的優點是容易獲得、DNA分布的質量高以及適用于小量的臨床針吸樣品。

原創作者:青島捷世康生物科技有限公司

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