ELISA 試劑盒的組成
在酶聯免疫吸附法中3個必要的條件，就是已經包被過的板，酶結合物和底物，ELISA還需要包被抗原或抗體的微孔板、陽性對照物、陰性對照物、酶結合物、底物及標本的稀釋液和反應終止液等試劑。所使用的材料主要指固相載體-微孔板。
一 固相載體
可作為ELISA固相載體的物質很多，例如聚乙烯、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、玻璃和硅橡膠等、但現已不多用。理想的ELISA板應該是吸附性能好、空白值低、透明度高、隔空的大小和性能相同。目前最常用的是聚苯乙烯、他有較強的吸附蛋白質的性能、并且不損害蛋白質的免疫活性，不行影響ELISA過程中的免疫反應和顯色反應，價格低廉，來源容易，因此被普遍采用
二 固相載體的特征
ELISA再提的形狀主要有3種：微量滴定板、小珠、小試管。以微量滴定板為常用，專用ELISA的產品成為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為8*12的96孔式。為便于做少量標本的檢測有制成8連孔條12聯孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板特顯是可以同時進行大量標本的檢測，并可以在特制的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀器用于微量滴定版型的ELISA檢測。包括加樣、洗滌、保溫、比色步驟，對操作的標準化紀委有利。聚苯乙烯經射線照射后，其吸收性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使股向上抗體量增多，但用于間接法測定抗體時空白值較大良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，隔板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產品質量差異較大，因此每一批號的ELISA板在使用前需要事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止反應后，分別測每孔溶液的吸光度。控制反應條件，使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個讀數與全部讀書的均讀數之差，應小于10%。
余聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體聚氯乙烯的特點是質軟板薄，可剪切，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白的吸附性能比聚苯乙烯高但空白值液略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優劣，可應用如下的實驗，用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將他們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上預訂的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別大，這種載體就是這一ELISA測定項目中最合適的固相載體。、
在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑為0.6cm的圓珠，表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。吸附面積的增大意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球形小珠的表面弧度更有利于媳婦的抗原決定粗或抗體結合位點的暴露面處于最佳反應狀體，因此珠式ELISA的放映往往更為靈敏。小珠的另一特點是更容易洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好，但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。
小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為100-200ul，而小試管可根據需要加大反應體積，標本反應量的增加有助于試管敏感性的提高。小試管還可以做比色杯，最后直接放入分光光度計中比色。
也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成顆粒作為ELISA固相載體的。其優點是表面積較大，反映在懸浮中進行，其速率與液相反應近似。以寒鐵的磁性顆粒為ELISA固相載體，反應后磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。
三 包被的方式
將抗原或抗體固定的過程叫包被。換言之，包被既是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子機構上疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，蛋白質的分子量、等電點、濃度等影響。載體對不同蛋白質的媳婦是非特異性的，受蛋白質的分子量等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，更容易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等故鄉具有較強的吸附能力，其聯結多發生在Fc段上，抗體結合點暴漏于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多可以采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴漏，在這種情況下，直接寶貝效果不佳，可以采用間接的補貨包被法，即先將針對該抗原的特異抗體做預包被，氣候通過抗原抗體放映使抗原固相化。此間接結合在股向上的抗原原理載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴漏。間接寶貝的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質量較多的抗原也可采用補貨包被法，實驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接包被的另一優點是抗原用量少，因為直接包被的1/10甚至更少。不易吸付在聚苯乙烯載體上的份蛋白質抗原可采用特殊的包被方式，例如在檢測抗DNA抗體時，需要DNA作為包被抗原，而普通的固相載體一般不能直接與核酸結合。可將聚苯乙烯板先經過紫外線照射，以增加其吸附性能。固相載體先用先用堿性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等做預包被，也可提高核酸的結合能力。液作用親和素系統做間接寶貝，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種方法均勻，牢固，以擴大大應用于各種抗原物質的定量測定。
脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置于冰箱過夜或冷風吹干，帶酒精揮發后，讓脂類自然干固在固相表面。抗心磷脂抗體的ELISA試劑一般采用這種包被方式
四 包被用抗原
用于包被固相載體的抗原按來源分為天然抗原，重組抗原和合成多肽抗原3大類
天然抗原可曲子動物組織、微生物培養物等，須經提取純化才能做包被用。如HB-sAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從其培養物中提取，蛋白成分抗原可從富含此抗原的材料中提取
重組抗原是抗原基因在質粒體中表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為智力題。重組抗原的優點是除工程菌成分外，其他雜質少，而且無傳染性，單純化技術難度較大。一大腸桿菌為智力題的重組抗原如不能充分去除大腸桿菌成分，用于ELISA，在反應中可出現假陽性。因不少受檢著受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質。例如丙型肝炎病毒尚不能培養成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中作用寶貝抗原大多為根據HCV的基因可控表達而制備的重組抗體。在傳染病診斷中，不少重組抗原HBsAg、HBeAg、HIV抗原均在ELISA中取得應用。
合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的莫伊抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。脫胎抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高。但由于分子量太小，往往難于直接洗孵育固相上。多肽抗原的包被一般需要先使其與無關蛋白質如牛血清白蛋白至等偶聯，借助于偶聯物與固相載體的吸附，簡介的結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一注意點為它僅能檢測語氣相應的抗體。一種蛋白質抗原往往含有多個不同的能引起抗體昌盛的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原放生反應。另外，默寫微生物發生變異時往往發生抗原結構的變化，在這種情況下用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗原的漏檢。
五 包被用抗體
包被固相載體的的抗體應具有較高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單可克隆抗體的腹水或培養液。如免疫用抗原中含有雜質.在抗徐慶忠將出現雜抗體，必須去除后才能用ELISA，以保證實驗的特異性。抗血清不能直接用于包被，影響提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和SEPHADEX凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析出提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性能不穩定。如需用高親和力的抗體包被以提高實驗的敏感性，則可采用親和層析法一出去康徐慶忠含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性較強，因此不需要做吸收和親和層析處理。一般講腹水做適當稀釋后直接寶貝，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某種情況下，用多種抗單混合包被，可取得更好效果。
六 包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度、包被的溫度和時間、包被液的PH值等應根據實驗的特點和材料的性質而選定。抗體和蛋白質抗原一般采用PH值為9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也用ph值為7.2的梨酸鹽緩沖液通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8攝氏度冰箱中放置過夜，37℃中保存2小時被認為具有同等的包被效果。包被的最適當濃度隨載體和包被物質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ul/ml
七 封閉
封閉是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液在寶貝的過程。抗原或抗體包被時所用濃度較低，吸收后固相載體表面尚有違背占據的空隙，封閉就是 讓大量不想關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%明教作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大特點是價廉，可以高濃度使用。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當做封閉劑使用，但由于奶粉的成分復雜，而且封閉后載體不易長期保存次芳芳較少應用。
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需要封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高，一般來說，雙抗夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可得到滿意的結果。特別是單抗腹水直接包被時。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。
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