融合蛋白的酶解和化學(xué)裂解方法
由于融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量較高，能夠促進(jìn)目的的蛋白的折疊和溶解性，并且純化方法簡(jiǎn)便，越來(lái)越多的人選擇用融合表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)目的的基因。蛋白融合表達(dá)后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模袝r(shí)需要將目的蛋白從融合蛋白上切割下來(lái)。本部分主要介紹融合蛋白中運(yùn)載蛋白的裂解方法
化學(xué)裂解法
化學(xué)裂解法操作簡(jiǎn)單、便宜、有效、甚至可以再變性的條件下裂解非變性情況下不能溶解的蛋白。其缺點(diǎn)在于有時(shí)目的蛋白中可能存在裂解位點(diǎn)，并且容易發(fā)生副反應(yīng)對(duì)蛋白進(jìn)行修飾。
溴化氫化學(xué)裂解法：溴化氫裂解蛋白的反應(yīng)在極低PH的條件下進(jìn)行。裂解發(fā)生在甲硫氨酸的C末端。雖然裂解效率高，但常發(fā)生側(cè)鏈的修飾及非特異性裂解
進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最短溫育時(shí)間：取50ul凍干的蛋白2份，其中一份重懸于50ul50mg/ml溴化氫/70%甲酸中，另一份重懸于50ul70%甲酸中，室溫下孵育。在0,4,8,16,24及48h分別取8ul樣品凍干。
樣品中加入SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min用SDS-PAGE電泳分析裂解效果，找出最短溫育時(shí)間。
按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積，用最短溫育時(shí)間進(jìn)行融合蛋白裂解
注意：1溴化氫有劇毒，實(shí)驗(yàn)需要在通風(fēng)櫥中操作。2 可以用6mol/L鹽酸胍/0.2mol/L鹽酸代替70%甲酸進(jìn)行反應(yīng)，尤其是當(dāng)?shù)鞍讓?duì)溴化氫有抗性或者蛋白為不溶性融合蛋白時(shí)。
羥胺化學(xué)裂解法：羥氨裂解蛋白中的天冬氨酸-甘氨酸間肽鍵。羥氨裂解法快速、經(jīng)濟(jì)、并且可以在變性的條件下裂解蛋白。需要注意的是該方法裂解通常是不完全的。
進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最短文娛時(shí)間：取50ul凍干蛋白樣品，重懸于20mmol/LTris-HCL(PH=8.0)中，與2X羥氨裂解緩沖液（4mol/L羥氨，0.4mol/L CHES緩沖液，NaOH調(diào)節(jié)PH=905，需新鮮配制）等體積混合，45℃孵育。在0,4,8,16,24及48h分別取8ul樣品。
樣品中加入SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min用SDS-PAGE電泳分析裂解效果，找出最短溫育時(shí)間。
按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積，用最短溫育時(shí)間進(jìn)行融合蛋白裂解
注意：1 當(dāng)?shù)鞍讓?duì)溴化氫有抗性或者蛋白為不溶性融合蛋白時(shí)，可以再反應(yīng)中加入6mol/L鹽酸胍。2 當(dāng)?shù)鞍讓?duì)溴化氫有抗性時(shí)，可以將羥氨終濃度提高到3mol/L.
低PH裂解法：在酸性條件下(PH=2.5),天冬氨酸-脯氨酸之間的肽鍵不穩(wěn)定。在37-40℃的溫度條件下酸性環(huán)境可以使肽鍵斷裂，但是酸性環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致蛋白的變性和修飾。
進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳水解條件：準(zhǔn)備下述4個(gè)反應(yīng)體系在37℃條件下溫育
A：20ug蛋白溶解在70%甲酸中：
B:20ug蛋白溶解在70%甲酸/6mol/L鹽酸胍中
C:20ug/蛋白溶解在13%乙酸中
D：20ug蛋白溶解在13%乙酸/6mol./L鹽酸胍中。
在0,12,24,48及72h分別8ul樣品，用0.1mol/L Tris堿中和后，加入SDS-PAGE上楊緩沖液，100℃5min用SDS-PAGE電泳分析裂解效果，找出最短溫育時(shí)間和最佳溫育條件
按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積，進(jìn)行融合蛋白裂解。
與化學(xué)裂解法比較，溶解的方法反應(yīng)條件吻合，而且實(shí)際應(yīng)用的蛋白酶具有高度的特異性，有較長(zhǎng)的底物識(shí)別序列（如凝血酶為6個(gè)氨基酸），在目的蛋白內(nèi)一般沒(méi)有其酶切位點(diǎn)存在。缺點(diǎn)在于酶的來(lái)源和純度。比如大部分公司提供的腸激酶都不是很純，可能污染有胰蛋白酶或其他物質(zhì)，可能造成蛋白的講解，因此，一般最好采用Sigma或Invitrogen公司的相關(guān)產(chǎn)品
1 凝血酶酶解法：凝血酶在精氨酸和賴氨酸殘雞后酶解蛋白。其最佳裂解氨基酸序列為疏水性氨基酸-疏水性氨基酸-精氨酸-賴氨酸-非酸性氨基酸-非酸性氨基酸。 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件： 取30ul蛋白溶液[懸于50mol/L Tris-HCL(ph=7.5)中，終濃度1mg/ml]，加入1u凝血酶，室溫下孵育。
在0,1,2,4及6h分別取5ul樣品，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min，用SES-PSGE電泳分析酶解效果，找出最佳溫育條件
按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積，進(jìn)行融合蛋白裂解。
腸激酶裂解法：腸激酶的酶解位點(diǎn)為(Asp)4-Lys序列，其反應(yīng)條件范圍款，可以再溫度4-45℃，PH4.5-9.5之間發(fā)揮作用，
預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件：取15ul蛋白溶液[懸于50mol/L Tris-HCL（ph=7.5）中終濃度1mg/ml]5份，分別加入0.2,0.5,1.2u的腸激酶，37℃孵育12h
取5ul樣品加入SDS-PAGE上楊緩沖液，100℃煮沸5min，用SDS-PAGE電泳分析酶解效果，找出最佳溫育條件
按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積，進(jìn)行融合蛋白裂解
逐一：如果蛋白發(fā)生講解，可嘗試加入適量5mmol/L EDTA.\
Xa因子酶解法：Aa因子在四肽（異亮氨酸-谷氨酸/天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸）的羥基端進(jìn)行切割，但是如果精氨酸序列后為精氨酸或者脯氨酸的話，Xa因子就不能酶解該蛋白。 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件：取20ul蛋白溶液[懸于50mol/l Tris-HCL(ph=7.5)中，終濃度1mg/ml]計(jì)入酶（終濃度10ug/ml）室溫下孵育。
在2，4,8及16h分別5ul樣品，加入SDS-PAGE上楊緩沖液，100℃煮沸5min，用SDS-PAGE電泳分析酶效果找出最佳溫育條件。、
按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積，進(jìn)行融合蛋白裂解。
注意：如果融合蛋白對(duì)Xa因子有抗性，把蛋白經(jīng)過(guò)變性在復(fù)性的處理后可能會(huì)消除蛋白的抗性。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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