捷世康生物是一家專注于生命科學和生物技術領域的“新星”企業,產品及代理品牌產品范圍涵蓋了分子生物學、細胞生物學、免疫學、生物化學等生命科學相關領域及相關實驗室消耗品
點擊下載該文件 日期:2021/7/26 10:30:10
產品簡介:
葡萄糖不僅是細胞能量代謝的主要底物,而且其代謝中間產物是生物合成的重要底物。植物可
通過光合作用產生葡萄糖。就哺乳動物而言,葡萄糖不僅是大腦神經系統、肌肉、脂肪組織等的唯一能源,而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關。
葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并產生過氧化氫;過氧化物酶催化過氧化氫氧化 4-
氨基安替比林偶聯酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。
試驗中所需的儀器和試劑:
可見分光光度計、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽和蒸餾水。
試劑一:葡萄糖 9mg×1支,4℃保存;臨用前加入1ml蒸餾水充分溶解為50μmol/mL 葡萄糖溶液, 用蒸餾水稀釋為 0.5μmol/mL 葡萄糖溶液-20℃ 保存;
試劑二:液體 25mL×1 瓶,4℃保存; 試劑三:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;
混合試劑的配制:使用前將試劑二和試劑三 1:1 等體積混合,用多少配多少。
一、葡萄糖提取:
1、組織的處理:稱取約 0.1g 樣本,加入 1mL 蒸餾水研磨成勻漿,置沸水浴中煮沸 10 分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,8000g,常溫離心 10min,取上清液備用。
2、細菌或細胞處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):蒸餾水體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 蒸餾水), 超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3S,間隔 10S,重復 30 次),置沸水浴中煮沸 10 分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,8000g,25℃離心 10min,取上清液備用。
1、分光光度計預熱 30min。波長調至 505nm,蒸餾水調零。
2、在 1.5mL 離心管中依次加入下列試劑:
試劑(μL) | 空白管 | 標準管 | 測定管 |
樣本 |
|
| 100 |
試劑一 |
| 100 |
|
蒸餾水 | 100 |
|
|
混合試劑 | 900 | 900 | 900 |
混勻,置 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)水浴中,保溫 15min,于 505nm 波長處讀取吸光度。
第 1頁,共 2 頁
1、按蛋白濃度計算
葡萄糖含量(µmol/mg prot)=C ×(A 測定管-A 空白管)÷(A標準管-A 空白管)×V 樣÷(Cpr×V
樣)
=0.5×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計算
葡萄糖含量(µmol/g 鮮重)=C ×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管) ×V 樣÷(W÷V
樣總×V 樣)
=0.5 ×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管) ÷W
3、按細菌或細胞數量計算
葡萄糖含量(µmol/104 cell)=C ×(A 測定管-A 空白管)÷(A標準管-A 空白管) ×V 樣÷(500÷V
樣總×V 樣)
=0.001 ×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標準管-A 空白管)
C:葡萄糖溶液濃度,0.5µmol/mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;V 樣:加入的樣本體積,
100µL=0.1mL;V 樣總:樣本總體積,1mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞數量,500 萬。
4、若 A 測定管大于 1.5,稀釋后進行實驗。